烯丙基半胱氨酸hplc,血浆同型半胱氨酸

作者：吴健翎 沈建昕 白雪梅

【摘要】 目的：探讨高效液相色谱法(HPLC)在测定血浆同型半胱氨酸含量中的应用。方法：血浆同型半胱氨酸用邻苯二甲醛(OPA)衍生,经Hypersil AAODS色谱柱（2.1mm×200mm，5μm），用0.02 mol·L-1NaAc∶乙腈∶四氢呋喃=56∶43.8∶0.2的流动相洗脱,柱温40℃,检测波长330nm,流速1.3mL·min-1。结果：线性范围为0.48～31.25μg·mL-1,回归方程为A=27.167C+38.765，r=0.9962;平均回收率为98.61%,RSD=1.84(n=6)，日内及日间相对标准偏差均小于5%。结论：该法准确、简便、快捷，适用于大多数实验室。

【关键词】 同型半胱氨酸; 高效液相色谱法

【ABSTRACT】 Objective: To set up the method for determining the content of Homocysteinein Human Plasma with HPLC. Methods: Column was Hypersil AAODS(2.1mm×200mm,5μm),using 0.02mol·L1Sodium acetate AcetonitrileTetrahydrofuran（56∶43.8∶0.2） Balanced Solution as mobile phase and detective wavelength at 330nm，the fiowing speed was 1.3ml·min-1，and Column temperature was 40℃.Results: The calibration curve was linear in the range of 0.48 ～ 31.25μg·mL-1 and ,The linear correlation equation was A=27.167+38.765(r=0.9962)The average recovery rate was 98.61%,and RSD was Between 1.84%（n=6）. The standard relative difference within a day and between two days was lower than 5%. Conclusion: The method is simple、accurate,and fast,which is suitable for the most lab test.

【KEY WORDS】 Homocysteinein；HPLC

同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)是一种含硫氨基酸,是蛋氨酸循环中S腺苷基高半胱氨酸水解酶水解反应的产物。研究表明, 血中 Hcy 升高可致流产、新生儿缺陷、中风、老年性痴呆及其它老年性疾病如骨质疏松等，维生素B12及叶酸缺乏、心脑血管疾病等都可反映出血浆Hcy浓度异常变化[1]。血浆中Hcy测定已成为国外诊断维生素B12及叶酸缺乏、早期心脑血管疾病监控疗效的常规方法。

同型半胱氨酸的测定常用放射免疫法[2]、荧光偏振免疫分析法[3]及HPLC法等[4～6]。本研究在参考有关文献的基础上，对色谱条件进行了适当的改进，使测定更加简便、快速,应用于实际样品测定,效果良好。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 HP1100高效液相色谱仪（包括在线脱气机、四元泵、柱温箱、荧光检测器、化学工作站），分析天平（A/D，1/10万，日本）。

1.2 试剂 衍生剂:50mg邻苯二甲醛(OPA)溶于4.5mL甲醇中,再加入0.25mol·L-1硼酸缓冲溶液(pH=8.4)0.5mL,巯基乙醇50μL,避光保存。1 g·L-1Hcy标准储备液:1mg Hcy溶于1mL 0.045mol·L-1HCl溶液中。Hcy标准品、邻苯二甲醛(Sigma公司)，甲醇、乙腈(色谱纯，天津科密欧化学试剂开发中心)，巯基乙醇、冰乙酸、乙酸钠、四氢呋喃均为分析纯试剂。三蒸水为本实验室自制。

2 实验方法

2.1 色谱条件

色谱柱为Hypersil AAODS（2.1mm×200mm，5μm），流动相：0.02mol·L-1NaAc(pH=7.20)∶乙腈∶四氢呋喃=56∶43.8∶0.2,柱温：40℃，流速为1.3mL/min,检测波长330nm,进样量：20μL。 2.2 标准曲 曲线的制作

以1g·L-1Hcy标准储备液做不同倍的倍比稀释，分别取40μL于6支5mL具塞离心管中,分别加入40μL过氧化氢,室温放置30min后于70℃水浴中用氮气吹干,各加入30μL巯基乙醇和70μL衍生剂,4min后取20μL进样。回归方程为：A=27.167CA+38.765，r=0.9962,线性范围为0.48～31.25.00μg·mL-1。

2.3 样品分析

a：同型半胱氨酸

图1 标准品（A）和血浆样品(B)的色谱图谱 取样品血浆0.5mL于具塞离心管中,加入0.5mL乙腈沉淀蛋白,离心后取上清液40μL于5mL具塞离心管中,分别加入40μL过氧化氢,室温放置30min后于70℃水浴中用氮气吹干,各加入30μL巯基乙醇和70μL衍生剂,4min后取20μL上机进样。色谱图见图1。表1 回收率结果 （μg·mL-1）

样品量加入量测得量回收率（%）平均回收率（%）RSD（%）11.130.101.25101.6221.130.101.19 96.7431.130.351.46 98.6541.130.351.47 99.3251.130.601.68 97.1161.130.601.70 98.2798.611.84

3 结果

3.1 标准曲线和方法学评价

对不同稀释度的Hcy标准溶液进行衍生处理后测定,结果表明,Hcy浓度在0.48～31.25μg·mL-1范围内,峰面积与浓度之间有良好的线性关系。

在同一份已知含量的血浆样品中加入不同量Hcy,测定方法的回收率。取3份浓度不同的血浆样本,分别测定日内及日间精密度，日内精密度为4.2%，日间精密度为4.4%，回收率结果见表1。

3.2 色谱条件的影响

用在测定血浆氨基酸的流动相的梯度条件下,测定Hcy，尽管也能达到测定目的,但一个样品的测定周期达40min,难以进行批量样品测定。为此,本试验用0.02mol·L-1NaAc (pH=7.20)和乙腈、四氢呋喃不同比例的等梯度洗脱,发现在0.02mol·L-1NaAc(pH=7.20)∶乙腈∶四氢呋喃=56∶43.8∶0.2时等度洗脱可达到最好的分离效果，且在20min内即可完成一个样品测定。该方法准确、简便、快捷，适用于大多数实验室进行实验研究及临床检测。

【参考文献】 1 席荣英,孙祥德,齐伟,等.反相高效液相色谱法测定血浆中同型半胱氨酸的含量[J]. 分析科学学报，2003，19（4）：352354

2 Fiskerstrand T,RefsumH,Kvalhein G,et al.Homocysteine and other thiols in plasma and urine:automated determination and sample stability[J].Clin Chem,1993,39(2):263265

3 沈佐君,吴琳.高效毛细管电泳法快速测定血清中游离氨基酸[J].中华医学检验杂志，1998,21(3):151154

4 张进凤,王金良,郑凌,等.酶免疫法测定血清总同型半胱氨酸及其临床意义[J].中国实验诊断学，1999,3(5):204205

5 何俊，丁敏，张晓清，等.高效液相色谱法同时测定血浆同型半胱氨酸及其相关硫醇物浓度方法的建立[J].中华检验医学杂志，2006,29(3)：203206

6 蔡东联,陈小莉.高效液相测定同型半胱氨酸方法的建立[J].氨基酸和生物资源，2001,23(1):4851

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