作者：袁保红，杜青平，邓祖军
【摘要】 目的 分析小连翘(Hyperioums sampsonii Hance)内生真菌的分布特征和抗菌活性。方法 采用内生菌分离法分离菌株，双培养法对峙试验测定其抗菌性。结果 从小连翘的根、茎、叶等不同的器官中分离得到81株内生真菌，经形态学分类鉴定分属于4个目，5个科，26个属，其中头孢霉属（Cephalosporium sp.）和丝核菌属（Rhizoctonia sp.）为优势菌群。不同部位内生真菌的类型、数量和分布存在差异，根部有31株，分属于12属；茎部有12株，分属于10属；叶部有38株，分属于13属。通过平板对峙实验发现，从小连翘所分离的内生真菌中54.32%对某些植物病原真菌有拮抗活性。结论 小连翘内生真菌及其代谢产物中具有潜在活性物质，值得深入研究。
【关键词】 内生真菌；小连翘；拮抗活性
Studies on communities of endophytic fungi from Hyperioums sampsonii Hance and their antipathogenic activities in vitro
Abstract: The endophytic fungi were isolated and identified morphologically from the roots, stems and leaves of Hyperioums Sampsonii Hance. Eightyone strains of endophytic fungi were isolated and belonged to 26 genera, 5 families and 4 orders. Cephalosporium sp. and Rhizoctonia sp. were the dominant genera. Among 81 strains, 31 strains of 12 genera were isolated in roots, 12 strains of 10 genera in stems, and 38 strains of 13 genera in leaves. The results showed that the quantity, population, and distribution of the endophytic fungi varied in different positions of Hyperioums Sampsonii Hance. In the dual culture tests, 53.48% of all the isolated Endophytic fungi showed antagonistic to some plant pathogens. These endophytic fungi inside the plants have intimate correlation with their hosts. These endophytic fungi and their metabolites might play an important role in the plants against the pathogens.
Key words:endophytic fungi; Hyperioums Sampsonii Hance; antipathogenic activities
小连翘(Hyperioums sampsonii Hance)，别名小翘、七层兰、瑞香草、元宝草等，为多年生双子叶植物药藤黄科植物，味苦、性辛、平［1］。全草含鞣质，有光致敏作用，动物食后可产生皮炎；含小连翘碱(hypecorine)和小连翘次碱(hypecorinine)；花含金丝桃素(hepericin)［2］，有活血、止痛、调经、止血、消肿之效；小连翘或其提取物作为有效药物成分用于制备治疗睡眠障碍、老年痴呆、记忆力减退等病症的药物［3］；同属植物贯叶连翘，在西方国家称圣约翰草，用于治疗忧郁症等疾病已有几百年的历史［4］。近年来的研究表明小连翘也具有抗忧郁作用［5］。文献报道，小连翘中含有聚（异）戊二烯二苯甲酮类衍生物、萘骈双蒽酮类和黄酮类等多种化学成分，这些成分是小连翘药理作用的主要有效成分，但是要提取和分离这些药物成分还有很多困难［6］。近来研究表明,某些药用植物中个别内生真菌能够产生与宿主相同或者相似药理活性的成分［7］，由此对药用植物内生真菌的研究引起人们的广泛关注。如果在小连翘内生真菌中能够发现类似的 的活性物质，无疑找到了一种可替代小连翘植物的新型生物资源。但是至今未见从小连翘中分离及其内生真菌的种群多样性的研究报道。本文对小连翘内生真菌进行了分离和分类鉴定，并对其种群多样性及内生真菌拮抗病原菌的活性的研究报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料 分离所用材料为小连翘的根、茎、叶，采自中国科学院华南植物园（广州）。采集其健康的组织，无其它病虫害，根、茎与叶分开采集，放于密封袋中，于4 ℃存放，尽快进行内生真菌的分离。 碘伏：威的牌消毒液，主要成份是聚乙烯吡咯烷酮碘（即碘伏），液体剂型，有效碘含量为0.5 %，是一种新型的PVP-I消毒剂，深圳市新华鹏消毒剂有限公司生产。 NS液：0.9 %NaCl；ST液：0.9 %NaCl，0.5 %吐温80；中和剂：0.9 %NaCl，0.5%吐温80，0.5 %硫代硫酸钠。
PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 000mL，pH7.0。在进行内生真菌的分离时，向培养基中分别加入青霉素、链霉素至50 μg/mL。
1.2 供试菌株 纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. Oryzae)、恶苗病菌(Fusarium moniliforme)、棉花枯萎病菌 (Fusarium oxysporium f. sp. vasinfectum)由中山大学生命科学院微生物和生化教研室提供。
1.2 方法
1.2.1 植物材料的处理 样品采于2005年10月。样品用自来水冲洗干净后，取不同部位的茎或叶若干，剪成小块，分别放于三角瓶中；加入碘伏消毒液（使用时有效碘浓度为2 500mg·L-1），不断摇动，消毒5 min。吸去消毒液，加入无菌ST液，荡洗1 min，吸去液体。重复一次。经表面消毒后的样品可用于接种。
1.2.2 内生真菌的分离、纯化 茎内内生真菌的接种：用无菌刀片削去茎的皮及已裸露的切面，然后切取约2～5 mm的切片若干，先置于无菌平皿中。再将样品置于无菌研钵中，加入石英砂和 1 mL ST液，将样品研成浆。取适量的浆液涂布于PDA平板。为了保证样品有足够的代表性，每个样品要用若干段茎，一段茎仅涂一个平板，共需涂5～10个平板。根叶样品的处理基本同茎。 将涂布好的平板置于28 ℃培养，每隔12 h观察真菌菌落形成情况。培养基中一出现菌落，立即将此处的小块琼脂挖出，将平板再放回28 ℃培养10 d，计数各平板上的菌落总数。挖出的含真菌的小块PDA立即置于含PDA的小试管中培养，待真菌长出后，再在PDA平板上采用菌丝顶端纯化法逐步纯化。待菌落出现后，根据菌落形态、颜色的差异以及长出时间的不同，分别挑取各平板上的菌落边缘的菌丝接于新的平板上进行分离培养。在培养数日后，观察菌落的形态及其菌落边缘的整齐情况，并做相应的记录，包括影象记录，对菌株编号后，转至PDA斜面培养基上，于28 ℃培养箱中培养5~7 d，然后放入4 ℃冰箱保存。
1.2.3 表面消毒效果检测 表面消毒后的样品于5 mL无菌水中振荡1 min，取0.3 mL悬液涂布于PDA平板上，在28 ℃培养，记录是否有真菌生长。另外，采用存活试验观察表面消毒效果，即将分离的内生真菌菌苔经过各自表面消毒程序处理后，再接种到PDA平板28 ℃培养后，观察是否生长。
1.2.4 菌种鉴定 从纯化培养数日的菌落上挑取菌丝并连同分生孢子制成玻片，置于光学显微镜下观察菌丝形态、孢子梗形态、孢子形态以及孢子与营养体之间的着生关系，对照有关资料确定真菌的分类学地位［8］。
1.2.5 对峙试验 将4种植物病原菌(纹枯病菌、稻瘟病菌、白叶枯病菌、恶苗病菌)接种于平板中央，内生真菌接种于平板边缘，28 ℃培养，观察病原菌菌落周围的变化。
2 结果
2.1 表面消毒效果 表面消毒后的样品振荡液0.3 mL分别涂布于PDA平板培养基上，28 ℃培养2周后无菌落长出，同时10株分离的代表性真菌菌苔分别经过消毒过程处理后接种到PDA平板上，28 ℃培养2周后，没有观察到菌落生长。表明经过样品消毒处理过程，样品表面附生菌的影响已消除，分离的菌株来自于样品内部，与植物组织结合紧密。
2.2 小连翘内生真菌种群组成 从植物小连翘分离获得内生真菌共81株。经显微形态观察鉴定为4个目，5个科，26个属（见表1）。从表1可以看出，植物小连翘内生真菌中，从目的分类水平上以丛梗孢目(Moniliales)和无孢菌群(Mycelia sterilia)
为优势菌群，分别为50株和23株占总菌株数的61.7%和28.4%；在属的分类水平上以头孢霉属（Cephalosporium sp.）和丝核菌属（Rhizoctonia sp.）为优势菌群，分别为20株和16株，占总菌数的24.7%和19.7%。
2.3 植物小连翘不同部位内生真菌的分布 对小连翘根茎叶内生真菌的种类，数目和分布部位进行统计分析，结果见表2。
表1 小连翘植物内生真菌种群组成（略）
Tab.1 The composing of endophytic fungi in Hyperioums sampsonii Hance
从表2中看出，从小连翘植株内分离的81株内生真菌的分布各有特点，根部分布有31株内生真菌(占总数的38.2%)，隶属于12个属(占26个属的 46.2 %)；茎部分布有12株内生真菌(占总数的14.9%)，分属于10个属(占26个属的 38.5 %)；从叶部分离出的38株内生真菌(占总数的469%)，分属于13个属(占26个属的50%)。由此可知，小连翘的内生真菌主要存在于植株的叶和根中，茎部组织中分离到的内生真菌相对较少。 从根茎叶中分离到的内生真菌的种属分布来看，头孢霉属（Cephalosporium sp.）在叶部、根部和茎部都有分布，说明头孢霉属（Cephalosporium sp.）不仅是叶部的优势种群，而且也是整株小连翘植物内生真菌的优势种群。丝核菌属（Rhizoctonia sp.）仅在根部分布，是根部的优势种群，占根部所有分离到的内生真菌的51%。另外，短梗霉属（Aureobasidium sp.）、鞘孢霉属（Chalara sp.）、束丝菌属（Ozonium sp.）也只在根部分布；而串珠孢霉属（Monilia sp.）、曲霉属（Aspergillus sp.）、粘帚霉属（Gliocladium sp.）、痕格霉属（Sirosporium sp.）、弯孢霉属（Curvularia sp.）、毛壳菌属（Chaetonium sp.）和直毛壳菌属（Ascotricha sp.）的内生真菌只在叶部分布，而叶组织内生真菌的优势种也和根部不同，头孢霉属和痕格霉属内生真菌是叶部的优势菌群；从茎部分离的内生真菌的优势菌群不明显，其中分离到的木霉属（Trichoderma sp.）、黑孢霉属（Nigrospora sp.）、芽枝霉属（Cladosporium sp.）内生真菌只在茎部分布。结果表明，小连翘根茎叶组织的不同部位所分离到的内生真菌的数量不同，所分离到内生真菌的分布和优势种群也存有差异。
表2 小连翘植物内生真菌数量?分布（略）
Tab. 2 The number and distribution of endophytic fungi species in Hyperioums sampsonii Hance
2.4 内生真菌对植物病原菌的拮抗作用 通过平板对峙试验分别对从小连翘中所分离的81株菌对植物病原菌纹枯病菌（立枯丝核菌）(Rhizoctonia solani)、白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. Oryzae)、恶苗病菌(Fusarium moniliforme) 、棉花枯萎病菌 (Fusarium oxysporium f.sp. vasinfectum)的抑菌活性进行测定（图1）。 结果发现,从小连翘中分离的81株内生真菌中共有53株对一种或多种病原菌有拮抗作用(占总分离株数的52.48%)。其中对恶苗病菌有抑菌作用的有23株，对白叶枯病菌有抑菌作用的18株,对纹枯病菌有抑菌作用的有12株，对棉花枯萎病菌有抑菌作用的有4株。这表明多数小连翘内生真菌具有抗植物病原菌的功能，在小连翘中存在着广泛的抗菌生物活性资源。
A.内生真菌J-53拮抗纹枯病菌; B.内生真菌f-55和f-166拮抗恶苗病
Dual culture between endophytes and pathogens
3 讨论
从近年来的研究看，植物体中存在内生真菌是普遍的。内生菌系统地分布于植物体根、茎、叶、花、果实和种子等器官、组织的细胞或细胞间隙。有报道说，内生真菌菌丝在宿主植物的叶鞘和种子中含量最多，而叶片和根中含量极少［9］。但是也有报道，根和叶内生真菌含量较多［10］。不同的植物可能具有的内生真菌的种类和数目相差很大。我们从中药植物小连翘的根、茎、叶共分离出81株内生真菌，分属于4个目，5个科，26个属。头孢霉属（Cephalosporium sp.）在小连翘根、茎、叶 内生真菌的分离过程中都得到，它既是叶内的优势菌群也是整个植物的优势菌群；丝核菌属（Rhizoctonia sp.）分离获得的数量比较多，但是它仅仅是根内的优势菌群。 植物内生真菌生活在活体植物组织中，其生长代谢受多方面因素制约，不仅受到宿主植物的影响，外界环境因子也是其重要影响因素。外界环境变化直接影响植物生长代谢，间接影响到植物内生菌生物多样性与生长代谢。从小连翘的根、茎、叶不同部位分离的内生真菌在数量、种类有很大的差异。小连翘的大部分内生真菌主要存在于叶和根部，而茎中相对很少，这表明不同的内生菌在植物不同器官和组织中占据不同的生态位。其原因可能是由于不同部位的微环境如通气状况、生物酶和其他化学成分的不同，从而适合不同种属的内生真菌类群的侵入和生长。 迄今的研究表明，植物内生菌与宿主发生联系时，对宿主有以下影响：可增强宿主的抗病性、提高植物的生产力［11］、抗逆抗虫［12］、具有除草剂活性［13］等。内生真菌对宿主的作用机制可能是由于内生菌在植物体内繁殖和生长，并产生丰富多样具有生物活性的次生代谢产物，从而在一定程度上调节植物的生长和代谢。通过对峙试验研究小连翘内生真菌对纹枯病菌、白叶枯病菌、恶苗病菌和棉花枯萎病菌等植物病原菌的拮抗性，结果发现，小连翘内生真菌中多数种类（约52.48%）能够抑制一种或者多种病原菌的生长，这表明小连翘内生真菌中存在着广泛的抗菌生物活性资源，这些内生真菌及其代谢产物在植物对抗病原菌的过程中占有一定的地位。由此可见，药用植物内存在着广泛的内生真菌，这些内生真菌可能成为生物防治中有潜力的生物因子，在生态农业和生物农药研制方面具有重要的用途。研究内生真菌的各种次生代谢产物及其作用机制，在农业和（或）医药业中具有重要的应用潜力。研究和开发植物内生真菌，从而为寻找植物病害的抗菌药用资源提供了一条新的途径。
【参考文献】
［1］谢宗万.全国中草药汇编下册［M］. 2版.北京:人民卫生出版社,1996:34-35;72; 263; 388-389;479-480.
［2］段静雨，阮金兰.小连翘化学成分研究［J］.中草药,2005,26(10):1461-1463.
［3］潘映红,郭宝林,彭勇.国产金丝桃属植物资源现状及利用前景［J］.中药材,1993,16(3):14-18.
［4］ BILIA A R, GALLORI S, VINCIERIFF S T. John’s wort and depression efficacy, safety and to ler ability an update［J］.Life Sciences, 2002, 70: 3077–3096.
［5］万德光,裴瑾,周明眉,等.三种贯叶连翘组植物醇提物对小鼠抗抑郁作用［J］.中药材, 2003, 26(3): 187-189.
［6］王泽剑,梁翠玲,毛志铭.圣约翰草提取物的临床研究进展［J］.国外医学:脑血管疾病分册, 2003, 11(3):212-214.
［7］吴芳婷,陈代杰,钱秀萍.植物内生菌抗菌物质研究新进展(英文)［J］.中国抗生素杂志,2004,29(3):184-192.
［8］魏景超.真菌鉴定手册［M］.上海:上海科学技术出版社,1982:129-649.
［9］李能章,彭远义. 植物内生菌研究进展［J］.生物技术,2004,14(2):69-71.
［10］李治滢,李绍兰,周斌,等.三种药用植物内生真菌抗真菌活性的研究［J］.微生物学杂志,2004,24(6):35-46.
［11］SHINIZU M,FURUMAI T,IGARASHI Y,et al.Association of induced disease resistance of rhododendron seedings with inoculation of Streptomycess sp.,R-5 and treatment with actionmycete D and amphotericin B to the tissue culture medium［J］.The Journal of Antibiotics, 2001,54(6):501-505.
［12］CLAY K,HOLAH J.Fungal endophyte symbiosis and planted diversity in successional fields［J］. Science,1999,285:1742-1745.
［13］PETERS S, DRAEGER S, AUST H J,et al.Interactions in dual cultures of endophytic fungi with host and nonhost plant calli［J］.Mycologia, 1998, 90:360-367
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