【摘要】 ［目的］研究五种游离蒽醌（芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等）的总含量与煎煮时间的关系。［方法］采用高效液相色谱法，以甲醇－0.1%磷酸（85∶15）为流动相，检测波长：254nm；流速：1.0ml/min，柱温：室温，检测生大黄煮沸之后每2分钟时所取水煎液样品中五种游离蒽醌的含量.［结果］在煮沸后20min内，五种游离蒽醌的总含量呈上升趋势；之后，呈下降趋势。［结论］沸腾后仍用武火继续煎煮约20min时五种游离蒽醌的总含量最高。
【关键词】 生大黄 游离蒽醌 高效液相色谱法
Abstract:［Objective］To determine the relation between the total count of the five free anthraquinone（A loeemodin，Rhein，Emodin，Chrysophanol，Physcion） in Radix et Rhizoma Rhei and the decoction time.［Method］HPLC was used with the chromatographic conditions as follows：mobile phase：methanol0.1% phosphonic acid solution = 85 ：15，detection wave length：254nm，flow rate：1.0 ml/min，column temperature：room temperature.The count of the five free anthraquinone in the decoction taken in every 2 minutes after the solution boiled was determined.［Results］During the 22 minutes after the solution was boiled，the total count took on a ascending tendency，afterwards，it took on a descending tendency.［Conclusion］The biggest number of the total count was obtained 20min after the solution was boiled.
Key words:Radix et Rhizoma Rhei；Free Anthraquinone；HPLC
大黄（Rheum officnale Baill）为蓼科植物掌叶大黄 （Rheum palmatumd）、药用大黄（Rheum officinale Baill）及唐古特大黄（Rheum tanguticum.Maxim.ex Balf）的根茎。生大黄具有泻下攻积作用而主要用于便秘，除此之外，还因其清热解毒、活血止血等功效，临床上广泛应用于急性胆道感染、急性细菌性痢疾、炎症性肠病、消化性溃疡等疾病。现代药理研究表明，生大黄中含有80多种不同种类的化合物，主要成分是蒽醌衍生物及二蒽酮类衍生物［1］。在抗菌及保护肠道粘膜等方面发挥作用的主要成份是游离蒽醌，包括芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等［2］。因煎煮时间不同，大黄水煎液中各成分的含量会发生变化，其功效也必然有所不同。本文采用高效液相色谱法探讨了煎煮时间对生大黄中五种游离蒽醌含量的影响，现介绍如下。
1 仪器、药品和试剂
Waters系列510 HPLC Pump；Shimadzu SPD10A UVVis检测器；浙江大学N2000 色谱工作站。大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素标准品：购自中国药品生物检定所；生大黄饮片由浙江中医药大学实验药厂提供，经本院中药教研室鉴定，为当年产正品生大黄。甲醇为一级色谱纯，液相色谱用水为纯净水，无水乙醚等其它化学试剂均为分析纯。
2 方法和结果
2.1 色谱条件 Hypersil BDS C18柱（4.6mm×250mm，10μm）；流动相：甲醇－0.1%磷酸（85∶15）；检测波长：254nm；流速：1.0ml/min；柱温：室温。在该色谱条件下生大黄中五种蒽醌类成分均达到基线分离，见图1。
A：对照品 B：样品 C：阴性对照 1芦荟大黄素 2大黄酸 3大黄素 4大黄酚 5大黄素甲醚
图1 HPLC 色谱图（略）
2.2 对照品溶液的 的制备 精密称取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚标准品各约1mg，置于10ml棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，备用。分别取以上各对照品溶液100μl，转移至1ml棕色容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，即得各标准品的混合溶液（每1ml中含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚10μg）。进样前用0.45μm滤膜过滤。
2.3 样品处理及供试品溶液的制备 称取10g生大黄，放入1000ml烧杯中，加入500ml水，于电炉上武火煎煮。以刚沸腾时为0min，取1.5ml水煎液，为第1个样品。之后每隔2min取1次样品，每次均取1.5ml，共采集20个样品。沸腾25min后改为文火煎煮。待样品冷却至室温后，吸取1ml溶液并转移至具塞试管中。每次用5ml无水乙醚萃取30min，共萃取5次。合并上清液，挥干乙醚，1ml甲醇溶解，即为供试品溶液。
2.4 标准曲线考察 精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液5、10、15、20、25μl，分别进样测定，以峰面积（Y）对含量（X）进行线性回归，得回归方程、线性范围及相关系数，结果见表1。
表1 各对照品的回归方程、线性范围及相关系数（略）
2.5 精密度试验 精密吸取上述混合对照品溶液，重复进样5次，测定峰面积，计算RSD（%），结果如下：芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚峰面积的RSD值分别为1.2%、1.0%、1.4%、0.9%、1.1%。
表2 精密度实验结果（略）
2.6 稳定性试验 取供试品溶液避光室温放置，分别于制备后0h、1h、2h、4h、8h和12h进行测定，结果大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素峰面积RSD分别为1.3%、1.8%、1.7%、2.2%、2.0%。其结果表明5种蒽醌在12h内基本稳定。
2.7 供试品含量测定 精密吸取上述混合供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪进行检测，每个样品重复2次。按外标法计算供试品溶液中各组分的含量，结果见图2。
图2 五种游离蒽醌的总含量与煎煮时间的关系（略）
3 讨论
3.1 文献显示在流动相中需加入一定量的高氯酸［3］、冰醋酸或者磷酸，本实验中我们选用了磷酸。通过比较0.5%、0.1%磷酸和0.15%磷酸条件下的峰型，认为0.1%磷酸条件下各峰的峰型均良好。研究表明在“2.1”色谱条件下，对照品和样品中五种蒽醌类物质的峰分离效果较好，与杂峰达到基线分离。因该方法灵敏度高、精密度高以及操作简单等优点，故认为该条件可用于检测大黄中的五种蒽醌类衍生物。
3.2 在研究五种游离蒽醌的过程中，不少实验只是侧重于含量的测定，或者是不同炮制、煎煮方法及不同配伍后含量有何差异，而对五种蒽醌类衍生物含量随煎煮时间的变化规律缺乏深入探讨。本实验采用高效液相色谱法，以水刚沸腾时为0min，取第一个样品，之后每2min取1次样品，分别检测每一个时间点的含量，不仅可以清楚地了解每一个时间点上各成分的具体含量，而且可以动态地观察煎煮过程中五种蒽醌类衍生物的变化规律。
3.3 如图2所示，在武火煎煮生大黄时，溶液沸腾后的20min内，五种游离蒽醌的总含量随时间的增加呈现上升趋势并达到最大值。此后，随着煎煮时间的延长，总含量呈下降趋势。
3.4 煎煮过程中五种游离蒽醌总含量的上升趋势，一方面可能是由于大黄游离蒽醌难溶于水，另一方面可能是大黄中具有含量优势的结合蒽醌类衍生物，在煎煮的过程中发生水解，转变为游离型蒽醌，故随着煎煮时间的延长游离型蒽醌逐渐增多［4］。之后游离蒽醌的下降趋势，可能是在煎煮过程中，不仅引起结合蒽醌的水解，更重要的是游离蒽醌的降解反应，甚至还存在蒽醌类成分间的化学转化［5］。相关机制仍需要进一步研究。
3.5 实验表明，在本实验中的煎煮方式下，沸腾后仍用武火继续煎煮约20min时五种游离蒽醌的总含量最高。这对于如何把握生大黄的煎煮时间以提高五种游离蒽醌的总含量，即最大程度地发挥生大黄的抗菌及保护肠道黏膜等作用，具有一定的借鉴意义。
【参考文献】
［1］ 黄泰康.常用中药成分与药理手册［M］.北京：中国医药科技出版社，1994：228228.
［2］ 郑学忠，王成群，黄仁福，等.生药学［M］.北京：人民卫生出版社.1992：5556.
［3］ XU ShunJun，LI Hongyan，ZENG Yuaner，et al.Determination of Five An thraquin ones in Rhein by RPHPLC［J］.LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH，2006，17（7）：12011202.
［4］ 高炳法，费健康.大黄煎煮时间对蒽醌甙的影响［J］.浙江中医学院学报，2000，24（4）：7273.
［5］ 苏子仁，曾元儿，周华.大黄煎煮过程的化学变化初探［J］.中国中药杂志，1999，24（5）：291292.
论文出处(作者):刘永涛 张红 葛尔宁
http://m.tuzhexing.com/peixun/437163/