作者：刘长玉 杜武勋 朱明丹 魏营 宋启刚 冯利民 苏金玲
【摘要】 目的观察芪参益气滴丸对急性心肌梗塞（AMI）大鼠不同时间点转化生长因子-β1（TGF-β1）的影响。方法制备AMI大鼠，随机分成假手术组、AMI模型组、芪参益气滴丸治疗组［3.5 mg/ （100 g?d)-1芪参益气滴丸混悬液灌胃给药］、卡托普利治疗组［1.012 5 mg/（100 g?d)-1卡托普利悬浊液灌胃给药］，每组又分4个时点(3 d，2周，4周，8周)，共16个组，每组9只。于实验结束后处死动物，分别取大鼠梗塞区及非梗塞区心肌，RT-PCR法检测TGF-β1的mRNA表达水平。结果AMI组TGF-β1 mRNA表达在梗塞区和非梗塞区与假手术组比较均呈现高表达趋势（P<0.05）；芪参益气滴丸治疗组与AMI组比较，梗塞区3 d，2周时TGF-β1 mRNA高度表达（P<0.05）； 4，8 周时TGF-β1 mRNA表达下降，但两组无显著性差异；非梗塞区各时间点TGF-β1mRNA表达均下降（P<0.05）。卡托普利治疗组与AMI组比较，梗塞区各时间点TGF-β1mRNA表达均下降，3 d，2周时两组有显著性差异（P<0.05）；非梗死区各时间点TGF-β1mRNA表达均下降（P<0.05）。论文论文参考网芪参益气滴丸治疗组与卡托普利治疗组比较，在梗塞区各时间点TGF-β1 mRNA表达均升高，3 d，2周，8周时两组有显著性差异（P<0.05）；在非梗死区各时间点TGF-β1 mRNA表达均下降，但两组比较无统计学意义。结论 芪参益气滴丸具有促进梗塞区心肌早期修复，同时抑制非梗塞区心肌胶原的增生，从而延缓心室重构的作用。
【关键词】 芪参益气滴丸； 急性心肌梗塞； 转化生长因子-β1； 心肌修复； 心室重构
Abstract：ObjectiveTo observe the effects of Qishenyiqi Dripping Pills on the expression of TGF-β1 mRNA in rats with acute myocardial infarction(AMI) at different time point.MethodsMyocardial infarction model was replicated by ligation left anterior descending branch of coronary artery in Wistar rats.Rats were randomly divided into sham operation group,AMI group,Qishenyiqi Dripping Pill group,Captopril group,and each group was divided into 4 different time points(3 days,2 weeks,4 weeks,8 weeks).The levels of TGF-β1 mRNA in the no infarct and infract area of left ventricle were examined by RT-PCR.ResultsThe mRNA expression of TNF-αin AMI group was significantly elevated as compared with sham rats (P<0.05). TNF-α in Qishenyiqi Dripping Pills group and Captopril group were markedly attenuated compared with MI group and there were significant differences in 2nd week,4th week and 8th week(P<0.05). TNF-αin infarct area of Qishenyiqi Dripping Pills group was markedly attenuated as compared with Captopril group (P<0.05). TNF-α in the no infract area of Qishenyiqi Dripping Pills group was markedly attenuated compared with Captopril group or 3rd day and in 2nd week (P<0.05).ConclusionQishenyiqi Dripping Pill ls can inhibit inflammatory reaction after acute myocardial infarction,relieve degree of myocardial injury, so as to protect cardiac function.
Key words：Qishenyiqi Dripping Pills; Acute myocardial infarction; Tumor Necrosis Factor-α; Inflammatory reaction
芪参益气滴丸主要成分为黄芪、丹参、三七、降香，具有益气通脉、活血止痛的功效，临床上广泛用于治疗心血管疾病。本研究通过建立大鼠急性心肌梗塞（AMI）模型，观察芪参益气滴丸对转化生长因子-β1（TGF-β1）的影响，探讨其促进AMI后心肌修复、抑制心肌纤维化，减轻心室重构的机制。
1 器材与仪器
1.1 动物 Wistar大鼠，雄性，体重200～250 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2007-0001。
1.2 药品和试剂及仪器芪参益气滴丸药物，由天士力医药集团公司提供（批准文号：国药准字Z20030139）。卡托普利药物由施贵宝药品公司提供（批准文号：国药准字H31022986）。TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0由宝生物工程（大连）有限公司提供。Trizol由InvitroGen公司提供。主要仪器设备包括：PCR仪（Hybaid Limited Equipent class1，英国），紫外分光光度计 uV－530（BECKMAN公司），DDY-11B型三恒电泳仪（北京六一仪器厂），凝胶成像系统 （英国 syngene公司），台式低温高速离心机（BECKMAN公司）。
2 方法
2.1 动物模型制备 按照文献［1］方法稍加改进，结扎大鼠左冠状动脉前降支(LAD)建立AMI模型。手术前后均记录体表心电图?以Ⅱ导ST段弓背向上抬高0.2 mm以上为结扎成功的标志。另设假手术组36只，其方法除不结扎冠状动脉外，余操作与AMI模型组动物相同。于术后给予青霉素4万U，肌肉注射1次/d，共3 d。
2.2 分组及给药 24 h存活大鼠随机分为假手术组、AMI模型组、芪参益气滴丸治疗组、卡托普利治疗组，每组又分4个时点(3 d，2周，4周，8周)，共16个组，每组9只。芪参益气滴丸组大鼠实验前称取一定量的浸膏，用0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)配成3.5mg/ml浓度的芪参益气滴丸混悬液，按3.5 mg/（100 g?d)给药。卡托普利组用0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)配成1.012 5 mg/ml浓度的悬浊液，按1. 012 5 mg/(100 g?d)给药，AMI模型组、假手术组予以生理盐水灌胃，至实验结束。
2.3 心肌总RNA的提取和细胞因子的检测
2.3.1 心肌总RNA的提取于3 d，2周，4周，8周实验结束后处死动物，分别取大鼠梗塞区及非梗塞区心肌100 mg用Trizol法提取总RNA，提取的总RNA用紫外分光光度仪分别测定A260，A280数值，所测得RNA样品吸光度A260/A280为1.8～2.0。
2.3.2 RT-PCR方法检测mRNA的水平PCR具体步骤是： 94℃预变性2 min， PCR扩增35个循环(94℃变性30 s，退火30 s， 72℃延伸2 min)。PCR产物经2%琼脂糖电泳分析结果，用光密度扫描计算TGF-β1与内参的比值。引物序列参照Genebank提供的cDNA序列，用Primer 5?0设计，由上海生物工程公司合成。
TGF-β1：sense 5，-gcc tcc gca tcc cac ctt tg-3，；antisense 5-gcg ggt gac ttc ttt ggc gt-3，。退火温度61.2℃，产物长度396bp 。内参β-actin：sense5，-cca acc gtg aaa aga tga cc-3，；antisense5，-cag gag gag caa tga tct tg-3，退火温度58.1℃；产物长度660 bp。
2.4 统计学方法 实验数据以±s表示，采用SPSS 10.0软件包，做单因素方差分析进行组间比较。
3 结果
AMI组TGF-β1 的mRNA表达
在梗塞区和非梗塞区与假手术组比较均呈现高表达趋势，两组之间有显著性差异（P<0.05）。
芪参益气滴丸治疗组梗塞区在3 d，2 周时TGF-β1 mRNA表达与AMI组比较高度表达，有显著性差异（P<0.05）；2周时更明显；4，8周时TGF-β1 mRNA表达较AMI同期有所下降，但无显著性差异；非梗塞区3 d，2周，4周，周时与AMI组比较，TGF-β1mRNA表达下降，有显著性差异（P<0.05）。
卡托普利治疗组与AMI组比较，在梗塞区对TGF-β1mRNA表达的影响在梗塞区，3 d，2周时与AMI组比较下降，有显著性差异（P<0.05）；4，8周时较AMI组下降，未显示统计学差异；非梗塞区3 d ，2周，4周，8周时TGF-β1与AMI组比较下降，有显著性差异（P<0.05）。
论文参考网 芪参益气滴丸治疗组与卡托普利治疗组比较，在梗塞区3 d，2周时，芪参益气滴丸治疗组TGF-β1 mRNA表达升高，卡托普利治疗组TGF-β1 mRNA表达降低，二者比较有显著性差异（P<0.05），4周时芪参益气滴丸治疗组高于卡托普利治疗组，但二者比较无差异；8周时芪参益气滴丸治疗组高于卡托普利治疗组，二者比较有显著性差异（P<0.05）。在非梗塞区芪参益气滴丸治疗组与卡托普利治疗组3 d，2周，4周，8周比较TGF-β1 mRNA表达均有下降，两组之间无显著性差异。结果见表1和图1～2。
表1 AMI大鼠TGF-β1的mRNA表达量比较（略）
与假手术组比较，*P<0.05； 与AMI组比较，△P<0.05；与卡托普利治疗组比较，#P<0.05；n=9
图1 梗塞区TGF-β1mRNA表达电泳图（略）
图2 非梗塞区TGF-β1mRNA表达电泳图（略）
4 讨论
TGF-β是一类具有多种功能且与心室重构相关的重要的生长因子。众多研究证明TGF-β刺激心肌成纤维细胞的增生、细胞外基质的沉积和心肌的肥大，其与基质金属蛋白酶(MMPs)相互作用影响心室重构发生、发展。TGF-β包括3种结构相近的同源异构蛋白(TGF-β1-3)，可以激活包括胶原在内至少60种以上细胞外基质的基因表达。TGF-β1可使心脏成纤维细胞发生表型转化，转变为具有收缩活性、可以大量合成胶原的肌成纤维细胞(MyoFb)。MyoFb通过自分泌/旁分泌形成合成TGF-β1，继而加速成纤维细胞的表型转化。MMPs是心肌梗塞后细胞外基质降解的驱动力量，与心肌梗塞后心室重塑之间存在因果关系。TGF-β1可以下调MMP-1的表达，同时上调组织型金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)，因而有助于胶原组织的沉积。此外，MMP-2与MMP-9可以通过酶切的方式激活TGF-β1。TGF-β1mRNA的表达在心梗后2 d开始升高， 7 d左右达高峰，其峰值与巨噬细胞在梗塞区浸润程度一致［2］。因此， TGF-β1的进行性升高是心肌梗塞区域组织修复过程的必要条件。本实验研究表明， TGF-β1mRNA表达在梗死区和非梗塞区与假手术组比较均呈现高表达趋势，二者之间有显著性差异；尤以梗塞区表达明显增高，这符合组织创伤后细胞因子表达的变化规律。本实验结果说明心梗后可通过上调TGF-β1表达发挥心肌的修复作用，这与目前国内外的研究是一致的。
随着炎症过程的消?，进入心肌梗塞慢性期， 即梗塞4周后， TGF-β1主要由MyoFb合成［3］。心肌的纤维化则主要表现为反应性纤维化。非梗塞区心肌间质有明显的巨噬细胞浸润和TGF-β1表达，说明这种反应性纤维化与炎性反应和TGF-β1表达有密切关系。因此抑制上述因素可以消退反应性纤维化，有益于改善心功能。可见，转化生长因子TGF-β1在心肌梗塞后呈现一个两面性，早期TGF-β1的高度表达促进了创伤的修复过程，而TGF-β1的过度表达则可以激活心脏交感肾上腺素系统，进而加速代偿性肥厚向心力衰竭的转化［4］ 。
目前的治疗主要针对于抗心肌纤维化。已有动物实验显示，直接针对降低TGF-β1的基因治疗可以明显改善心肌梗塞后心室重塑过程［5］；通过抑制TGF-β1系统，可以降低心肌组织胶原的合成量、减轻间质纤维化和非梗塞区心肌肥厚，改善心力衰竭。大量研究显示， ACEI可通过降低循环RAS活性、影响血流动力学因素继而改善心肌梗塞后心室重塑过程。虽然ACEI已成为急性心肌梗死后改善心室重塑的基本临床用药［6］ ，其临床收益已在大量临床研究中的得到证实，但是ACEI的抗纤维化作用在心肌梗塞后早期的修复过程中的意义是需要审慎考虑的。因为AMI后至梗塞部位瘢
痕形成之前的心脏，处于心室内压力作用的易损期，任何影响胶原沉积的因素，均会影响心室的构型［7］ 。已经有研究显示， ACEI可以在急性期降低梗塞区细胞外基质的合成量，继而有可能加速梗死区的膨展、变薄和心室腔的扩张［8］ 。因此，合理的调节TGF-β能延缓和阻滞心肌肥大、心肌纤维化和左心功能衰竭，但同时应注意早期过度抑制TGF-β，将对心肌组织的修复、维持心脏的几何形态是不利的。
本研究显示，芪参益气滴丸治疗组梗塞区在3 d，2周时TGF-β1 mRNA表达与AMI组比较高度表达；2 周时更明显；4周，8周时TGF-β1 mRNA表达较AMI同期有所下降，但无显著性差异；初步可以提示益气活血中药芪参益气滴丸可具有上调TGF-β1 mRNA表达，促进组织修复的作用，但是在4周时TGF-β1mRNA表达已经开始下降，表明芪参益气滴丸对TGF-β1mRNA表达可能具有先促后降的作用，这对于组织修复中，防止过度修复可能有利。
芪参益气滴丸方中的丹参有活血化淤之功效，黄芪有益气生肌及解毒之功效。关于益气活血中药活血生肌，促进组织修复，减轻组织瘢痕的作用，已经得到许多研究结果的证实。丹参具有促进成纤维细胞增生及功能活跃的作用，应用丹参后成纤维细胞数量明显增多，细胞器功能明显活跃等现象，证明丹参使成纤维细胞的蛋白质合成旺盛，进而使胶原原纤维及胶原纤维增多。证明了丹参有促进胶原纤维的合成的作用。本研究证明芪参益气滴丸具有促进梗塞区心肌早期修复，减轻梗塞区膨展，同时抑制非梗塞区心肌胶原的增生，减轻心室纤维化，从而抑制心室的扩张，延缓心室重构，改善心脏功能。
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http://m.tuzhexing.com/kaoshi/361834/