作者：梁亦龙 舒坤贤 何伟 韦平 查毅 张燕红 韦衍颜 胡娟
【摘要】 目的测定仙人掌对辐射小鼠bcl-2与p53基因表达影响。方法以UVB辐照制备损伤模型，预先给予仙人掌，以RT-PCR测定仙人掌对辐射小鼠bcl-2与p53基因表达量的影响。结果仙人掌对辐射小鼠bcl-2的基因表达降低有保护作用，使辐射后p53基因表达降低。结论仙人掌具有一定的防辐射作用。其抗辐射作用与其调控细胞bc1-2与p53基因有关。论文论文参考网
【关键词】 仙人掌 辐射 bcl-2基因 p53基因
Abstract:ObjectiveTo study the effects of genistein on bone marrow cell cycle，proliferation and expression of bcl-2 gene and p53 gene of normal and irradiated mice.MethodsThe irradiation damage model of the mice caused by UVB was established．The bcl-2 and p53 mRNA gene expression was also determined with the technology of RT-PCR.ResultsOpuntia could increase the bc1-2 gene expression and decrease the p53 gene expression in irradiated mice.ConclusionThe radioprotective effect of Opuntia is related to regulation of cell apoptosis and bc1-2 and p53 gene expression.
Key words:Opuntia dillenii; Irradiate; bcl-2 gene; p53 gene
仙人掌为仙人掌科(Cataceae)仙人掌属(Opuntia)植物。仙人掌作为药用植物已有悠久历史，具有行气活血、清热解毒功能。国内外对仙人掌的成分及其药理作用进行了较系统的分析。研究表明仙人掌具有降血糖、降血脂、降血压、抗氧化、抗炎、抗肿瘤、增强免疫力及治疗胃溃疡的作用，本实验研究仙人掌对辐射小鼠血液细胞周期调控基因表达影响。以往研究发现，仙人掌具有较强的抗氧化，能延缓衰老的作用［1,2］。经紫外辐射后对相关细胞的影响是辐射损伤与修复的重要基础。照射后相关细胞凋亡或坏死、细胞周期改变及增殖抑制是辐射损伤发生的主要原因，相关实验研究指出，仙人掌具有较明显的抗氧化性作用，可使血液中SOD活性升高，MDA含量降低［3］。本实验研究仙人掌对辐射小鼠bcl-2，p53基因表达影响，为仙人掌的利用与开发积累相关的资料。
1 材料与方法
1.1 试剂
仙人掌，购于重庆南岸超市，经脱水处理而成并用高速中药打粉机打碎，干燥保存。总RNA 提取试剂盒, 逆转录PCR 反应试剂盒和DL2000 DNA Marker (大连宝生物工程有限公司提供)；β- actin 引物，bcl-2引物，p53引物(上海基康公司合成)。
1.2 动物及分组
昆明种小鼠，雌雄各半，体重（20±2）g，由重庆中药研究院实验动物科提供。正常对照及阴性对照组各6只,0.2 ml生理盐水灌胃,1次/d；辐射对照组、仙人掌小剂量组和仙人掌大剂量组，每组8只动物。小剂量组和大剂量组的小鼠分别以〔2.5 g/(kg?d)，10.0 g/(kg?d)〕 将仙人掌粉按比例混入基础饲料中，其他两组以等量蒸馏水灌胃，到第7天时，两个剂量组和辐射对照组的小鼠给予全身中波紫外射线照射(UVB，270 nm)，4 h/d，持续7 d后，在无菌条件下分别取股骨骨髓，并制成细胞悬液进行检测。
1.3 RT-PCR检测相关基因表达的变化
1.3.1 RNA的提取RNA提取和鉴定采用Trizol提取液，按照试剂盒说明书提取骨髓细胞RNA。采用紫外分光光度计, 测定样品在波长260 nm和280 nm的紫外吸收值。根据1 OD260相当于40 g/ml RNA确定RNA的量,根据OD260/OD280 比值判定RNA样品的纯度(OD值为1.8～2.1为宜)。
1.3.2 cDNA第一链的合成取一0.5 ml eppendorf管，加入2 μg总RNA， 2 μl oli igod(T)，4℃ 8 000 r/min稍离心后，70 ℃水浴5 min，迅速置于冰上冷却，加5×反应缓冲液(M2MLV ) 5 μl，dNTP(10 mmol/l) 3 μl，M2MLV反转录酶( 200 U /μl) 1 μl，再加无酶水至总体积为25 μl(均在冰上进行)。稍离心后，42℃水浴60 min。所得的产物即为cDNA，置于-20℃保存。
1.3.3 引物设计bcl-2上游引物：5""-AGGGGG AAA CAC CAG AAT C-3 ；下游引物为：5""-GGT AGC GAC GAG AGA AGT CA-3，长度为492 bp；p53上游引物：5""-ACCCAGGTCCAGATGAAG-3；下游引物5""-GGAGTACGTGCAAGTCACAG-3，扩增片段长度为217 bp；β-actin为内参引物，上游引物：5""-CACTGT GCC CAT CTA TGA GGG TTA C-3 ；下游引物为：5""-CAT TGC CGA TAG TGA TGA CCTGAC C-3，长度为275 bp。引物由上海基康公司合成。
1.3.4 聚合酶链式反应( PCR)扩增PCR扩增p53，bcl-2 cDNA反应体系：10×Buffer 2.5 μl，dNTP 2.5 μl，引物各0.5 μl，Taq DNA酶0.05 μl，加ddH2O至总体积25 μl。PCR反应程序：95℃ 90 s，94℃ 40 s 56℃ 40 s(bcl-2)与58℃ 40 s(β-actin)，72℃ 40 s，×30，72℃ 7 min，40℃ 结束；p53按下述条件进行PCR扩增：94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 30 s，×28，72℃ 7 min结束。取RT-PCR反应产物8 μl，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶扫描成像分析仪处理系统分析结果。测定bcl-2/β-actin 与p53/β-actin 比值，即为相对的bcl-2与p53基因mRNA 含量。
1.4 统计学方法统计学数据用±s表示。采用SPSS 12.0软件处理。
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2 结果
实验结果显示, 紫外线处理各组小鼠骨髓细胞bcl-2与p53 mRNA表达不同，紫外处理各组bcl-2 mRNA的表达，对照组的表达最高，模型组最低，喂食仙人掌后，表达量随之升高，p53 mRNA表达均比正常对照组高(P<0.05)，其中模型组表达量最高，喂食仙人掌后，表达量随之降低。说明紫外线处理后引起p53基因的表达增强，从而增加对组织细胞的保护作用。紫外线处理加高剂量和加低剂量的仙人掌喂食后，bcl-2与p53 mRNA的表达的变化，显示出仙人掌对紫外线处理后的小鼠细胞凋亡具保护作用，增强对机体保护作用。见表1～2。表1 对辐射小鼠骨髓细胞bcl-2 mRNA表达的影响（略） 表2 对辐射小鼠骨髓细胞p53 mRNA表达的影响（略）
3 讨论
中波紫外线（UVB）照射可以引起体内外细胞发生凋亡，在形态上表现为：早期细胞膜、核膜、细胞器完整，细胞质、细胞核固缩；晚期部分胞膜包裹部分细胞质和部分细胞核形成凋亡小体。其机制主要是DNA直接损伤，二聚体的形成，基因突变，免疫抑制以及细胞膜受体被激活。这与辐射后产生大量羟自由基，进而诱导脂质过氧化，出现生物大分子损伤等改变有关［4］。仙人掌具有良好的抗氧化作用，能抑制或清除自由基［3］。
bcl-2属于细胞凋亡的抑制基因，其高表达可抑制由于γ射线和多种化学药物导致的细胞凋亡［5,6］。文献报道，射线诱导的细胞凋亡在DNA 降解的同时，伴随有bc1-2 mRNA的同步降低。过量表达可防止由于去除生长因子而诱导造血干细胞凋亡和辐射敏感性降低、并促进造血细胞增殖，在辐射损伤后骨髓再生期的过量表达是促进造血细胞凋亡后再修复的原因之一 。而辐射损伤主要是由于自由基的产生引起的。仙人掌可使辐射小鼠bcl-2表达增加，因而可提高机体辐射耐受性［7］。
p53 作为一个中心调控因子起着重要作用。已有研究证明p53 水平与细胞的放射敏感性有关。化疗试剂、缺氧、核苷酸消耗及癌基因表达等多种刺激可诱导p53基因表达，从而转录激活或抑制其下游基因的表达。p53基因生物学效应主要包括细胞周期负调控、DNA复制与修复、细胞凋亡、抑制血管生成以及应答细胞胁迫等［7］。辐射导致的DNA 损伤细胞应答过程必须有p53 参与。p53 表达与辐射诱导的细胞凋亡密切相关。p53功能之一是作为细胞周期G调控点发挥作用,各种原因导致DNA 损伤均可引起p53的增加［8］。本实验通过R T-PCR检测显示,紫外辐射模型组小鼠骨髓细胞中p53过度表达，提示p53 基因存在错意突变或细胞大批凋亡；与之相比仙人掌组小鼠骨髓细胞中p53基因表达受抑制。由此推断仙人掌可通过对抗紫外辐射导致的p53基因突变，减少细胞凋亡，保护小鼠骨髓细胞免受辐射损伤。
本研究在从分子生物学基因调控信号转导角度，探究了仙人掌抗紫外辐射损伤小鼠骨髓细胞的分子机制，证明了仙人掌能够对抗紫外射线辐射损伤，为开发保健食品或药物提供了新思路。
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http://m.tuzhexing.com/kaoshi/355269/