作者：赵瑜，冯齐凤，朱祝生，刘日光
【摘要】 目的为了解中药补肾方对体外培养软骨细胞的作用。方法取Wistar大鼠关节软骨，将软骨细胞分离传代后，分为补肾方含药血清组和对照组，置入37 ℃，50 ml/ L 的CO2培养箱内培养7 d 后，采用MTT 法检测细胞增殖； TUNEL 法检测各组软骨细胞的凋亡。结果中药补肾方高、中、低剂量组细胞增殖均高于对照组( P<0. 05) ；中药补肾方含药血清各组的软骨细胞凋亡率明显低于对照组( P<0. 05) 。结论中药补肾方可促进软骨细胞增殖与抑制软骨细胞的凋亡。
【关键词】 补肾方 细胞培养 软骨细胞
Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of kidney-supplementing Prescription extracted from traditional Chinese medicine on Chondrocytes cultured in vitro.MethodsThe chondrocytes were isolated from the cartilage of Wistar rats , and were divided into 5 % , 10 % , 20 % kidney-supple- menting prescription -containing serum groups and control group. After the chondrocytes were cultured for 7 days in 37 ℃,50 ml/ L CO2 incubator , their proliferation and apoptosis activity were detected with MTT and TUNEL respectively. ResultsThe proliferation of chondrocytes in 5 % ,10 % ,20 %prescription containing serum groups were respectively higher than those in control group ( P< 0. 05) ;their apoptosis were respectively lower than those in control group ( P< 0. 05) .ConclusionKidney-supplementing prescription can not only stimulate proliferation of chondrocytes,but also inhibit the apoptosis of chondrocytes.
Key words:Chondrocytes; Apoptosis; Chondrocyte
骨关节炎是临床常见的关节退行性疾病,是导致老年人肢体功能障碍的主要原因。论文论文参考网主要的病理特征是软骨质的降解和软骨中细胞数目明显减少,软骨基质的合成和分解代谢失调, 最终关节软骨被破坏。而软骨中唯一的细胞是软骨细胞,软骨基质主要是由软骨细胞合成和分泌的。因此,软骨细胞的分裂增殖及凋亡的异常在骨关节炎的发病中起到十分重要的作用。补肾方药临床治疗骨关节炎疗效显著,本研究主要从补肾方药对软骨细胞增殖的影响,探讨其防治骨关节炎的作用。
1 材料与方法
1.1 动物
Wistar大鼠，180～200 g，雌雄各5只,由贵阳医学院动物实验中心提供。
1.2 试剂
胎牛血清(美国Sigma ，使用前灭活) 、Ⅱ型胶原酶(美国Sigma) 、1.0 g/L 胰蛋白酶、0.2 g/L EDTA、DMEM 培养液( Gibco) 、二甲基亚砜、MTT(美国Sigma) 、TUNEL 成套试剂盒(湖北省武汉博士德生物工程公司产品) 。
1.3 鼠血清制备
Wistar大鼠14 只，雌雄各半。补肾方(为经验方，由淫羊藿、牛膝、黄芪等组成) 组，按体表面积折算动物的等效剂量,再按5 ml/ d 灌胃,正常鼠血清以9. 0 g/ L氯化钠注射液按5 ml/ d 灌胃。连续灌胃2 次,中间间隔2 h ，分别在末次灌胃后3 h 采血。在乙醚和氯胺酮复合麻醉下鼠腹主动脉采血，4 ℃冰箱过夜后，离心(2 500 r/ min) 25 min ，取上清液，抽滤除菌后分装， - 20℃保存备用。
P> 1.4 软骨细胞分离与培养取Wistar大鼠（180～200 g），处死大鼠后，无菌条件下取下股骨头，髌骨，股骨髁，胫骨平台软骨，将软骨剪碎，以PBS清洗两次，0.25%胰酶消化30 min，去除胰酶，PBS清洗两次，以1∶10的比例加入0.2%的II型胶原酶溶液，置37℃水浴中轻微振荡，消化4 h，直至软骨组织块基本消失，溶液变浑浊为止，以1 500 r/min离心10 min，去上清，加入PBS清洗细胞，在细胞团中加入含10%FBS的DMEM全培养基（含100 U/ml青霉素，100 U/ml链霉素，10-8M地塞米松，VitC 50 μg/ml），将细胞团制成悬液，以200目筛网过筛，收集滤液，以6×106/ml密度接种，置37°C，5% CO2培养箱中培养，首次换液在3 d后，其后每2 d换液1次，至细胞长满培养瓶时传代。
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1.5 含药血清的加入
传代细胞接种在24 孔板中，接种密度2 ×104 个/ cm2 ,分对照组(正常血清) 、补肾方实验组(含药血清分别为5%，10%，20%) 。每组选6 个培养孔，分别用相应的血清培养。
1.6 MTT增殖测定软骨细胞培养5 d 后，每孔加MTT 20 μl (5 mg/ ml) 溶于PBS中,滤过除菌,放入培养箱4 h ，取出，每孔加入50 μl二甲基亚砜，振荡混匀使结晶物充分溶解。在全自动酶标仪上检测光密度(OD) 值，检测波长为492 nm。
1.7 TUNEL 法检测软骨细胞的凋亡按检测试剂盒说明书操作。以胞浆出现棕色细小颗粒为阳性结果。阳性率计算：计数5 个视野中的阳性细胞核(?浆) 数及总细胞核数，并计算阳性细胞核数占细胞核总数的百分比。
1.8 数据处理采用SPSS10.0统计软件包进行独立样本t检验，数据以±s表示。
2 结果
不同浓度的补肾方含药血清对培养软骨细胞均显示增殖刺激作用，与对照组比较P<0.05。不同浓度的补肾方含药血清对软骨细胞凋亡率明显低于对照组, 差异存在显著性P<0.05。结果见表1。表1 补肾方对家兔软骨细胞增殖、凋亡率（略）
3 讨论
骨关节炎是一种临床常见的老年人关节的退行性病变，它的发病率与年龄密切相关。Cooper 等［1］研究表明，60 岁后，100 %的人膝关节软骨将发生组织学退变；60 %～ 70 %的个体存在确定的膝OA 证据。我国50 岁以上的人群中骨关节炎的发病率约为50 % ，而65 岁以上患有此病的女性和男性分别高达90 %和80 %。 软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞，它与由其分泌的细胞外基质共同组成具有独特力学和生物学特性的物质，即软骨。因此，软骨细胞在软骨形成、代谢以及修复中起着极其重要的作用。骨关节炎是以关节软骨丢失以及软骨细胞功能降低或丧失为主要特征的一类退行性关节疾病。但软骨的修复是一个复杂的组织学变化过程，软骨细胞在骨关节炎修复中起着十分重要的作用。如何促进软骨细胞的增殖和延缓软骨细胞凋亡，是需要研究的问题。
中医药学在骨关节病的临床治疗中积累了丰富的经验，为了进一步研究中医药延缓软骨退变的作用机理，有必要建立软骨细胞体外培养体系。而中药复方多数是通过口服而起作用的，用中药粗制剂直接加入离体反应体系中进行实验研究，在方法学上存在很多问题，如：中药中的杂质成分、各种电解质或鞣质、以及不同酸碱度的影响等，都会对实验结果造成一定的影响［2，3］。而用含药血清进行体外实验，可以排除以上各种因素的影响,比较接近药物体内环境中产生药理效应的过程。MTT光密度表达，反映了细胞增殖活性，反映一定时间的细胞增殖速度［4］。细胞凋亡的检测方法主要包括形态学、生物化学、细胞学和分子生物学等改变。其中最重要和特征性的改变是Ca2+ /Mg2+依赖性核酸内切酶的激活导致染色质DNA在核心小体连接部位断裂，形成以180～200 bp 为最小单位的单体或寡聚体片段。因此，细胞凋亡过程中DNA降解所产生的DNA片段大小具有独特性质，常作为细胞凋亡特异性指标，其中TUNEL 法则被广泛应用的方法之一。本实验结果表明，中药补肾方含药血清各浓度组的软骨细胞增殖OD值明显高于对照组( P< 0. 05) ，说明其能促进软骨细胞的增生；而软骨细胞凋亡率明显低于对照组( P< 0. 05) ，说明其具有抑制软骨细胞的异常凋亡的功效；说明中药补肾方能通过抑制软骨细胞异常凋亡，促进软骨细胞增殖从而起到防治骨关节炎的作用。但本实验结果是中药补肾方含药血清对体外培养成骨细胞的直接作用，其作用机理有待深入探讨。
【参考文献】
［1］Cooper C. Osteoarthritis epidemiology ［A］.In : KlippelJ ,Dieppe P (eds) . Rheumatology［C］.London : Mosby ,1994：731.
［2］张群豪,陈可冀. 血清药理学在重要及复方研究中应用的评价［J］.中国中西医结合杂志,1996 ,16(3) :131.
［3］崔晓兰,贺玉琢,高英杰,等. 中药药理研究的新思路［J］.中国中医药科技,1997 ,4(4) ：239.
［4］朱文菁.MTT法分析培养成骨细胞的存活和增殖能力［J］.上海医科大学学报，1995，22（33）：254.
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