作者：赵振华，严萍，焦旭雯，赵树进
【摘要】 目的 建立和优化ISSR-PCR反应体系。方法通过单因素实验研究ISSR反应体系中主要成分（模板、Taq DNA聚合酶、Mg2+、引物、dNTPs）以及退火温度对扩增结果的影响。结果建立了适合何首乌ISSR分析的反应体系和扩增程序，即在25 μl反应体系中，内含1×Taq酶配套缓冲液、100 ng模板、1.5 U Taq DNA聚合酶、1.5 mmol/L Mg2+、0.6 μmol/L引物、0.2 mmol/L dNTPs。扩增程序为94℃预变性5 min；然后是94℃变性45 s，（据不同引物的退火温度）复性1 min，72℃延伸1.5 min，共35个循环；72℃延伸7 min，4℃保存。结论这一优化体系的建立为今后利用ISSR标记技术进行何首乌鉴定及种质资源遗传多样性分析提供了一个标准化程序。论文学术科研网
【关键词】 何首乌；简单重复序列区间扩增多太性； 反应体系； 建立与优化
Abstract:ObjectiveTo establish and optimize ISSR-PCR reaction system for Polygonum multiflorum Thunb.MethodsSingle factor experiment method was used to present the effect of the main reaction system elements (Taq DNA polymerase, template DNA,Mg2+,primer,dNTPs) and annealing temperature on ISSR-PCR. ResultsA reaction system and amplified procedure suitable for Polygonum multiflorum Thunb. were established, that was, 25 μl reaction system containing 1×PCR buffer,100ng template DNA,1.5 U Taq DNA polymerase,1.5 mmol/L Mg2+,0.6 μmol/L primer,0.2 mmol/L dNTPs. The optimal amplified procedure was as follows: after a pre-denaturing of 5 min at 94℃, 35 cycles were performed with denaturing of 45 s at 94℃, annealing of 1 min according to denaturing temperature of different primer, extension of 1.5 min at 72℃, a final extension step of 7min at 72℃ and hold at 4℃. ConclusionThis optimal system lay the standardization program for the identification of Polygonum multiflorum Thunb. and the genetic diversity analysis of its germplasm resource.
Key words:Polygonum multiflorum Thunb.; Inter Simple Sequence Repeat; Reaction system; Establishment and optimization 何首乌Polygonum multiflorum Thunb.为蓼科多年生缠绕草本植物，始载于《开宝本草》，喜生于温湿、腐殖质丰富的砂土，主产于河南、广东、贵州、江苏、湖北、四川等地。其块根及藤均为名贵中药材，生首乌能解毒，消痈，润肠通便；制首乌能补肝肾，益精血，乌须发，强筋骨；首乌藤养血安神，祛风通络。 ISSR（inter-simple sequence repeat,简单重复序列区间扩增多态性）标记是Zietkiewicz等［1］于1994年建立的一种基于PCR的新型分子标记技术。近年来，ISSR已广泛应用于植物品种鉴定，种质资源和遗传多样性的研究，并作为构建遗传图谱的工具［2,3］。该技术无需预知受试基因组序列，多态性高、操作简单、成本低廉，且扩增时退火温度比较高，保证了PCR扩增的可重复性，被认为是非常理想的研究 究居群问题的分子标记。目前对何首乌化学成分、药理作用和临床应用等方面的研究较多［4～6］，但应用ISSR分子标记对何首乌种质资源进行分子水平的研究尚未见报道。本研究详尽探讨了何首乌ISSR反应的优化条件，建立了重复性好、结果清晰而稳定的何首乌ISSR反应体系和扩增程序，为进一步利用该标记技术进行何首乌鉴定及种质资源遗传多样性分析奠定了良好的基础。
1 器材与方法
1.1 材料
何首乌样品采自湖北恩施，经华南植物园邢富武教授鉴定，用干燥剂将叶片干燥后置于-20℃冰箱备用。
1.2 仪器与试剂
TC-XP型基因扩增仪；Bio-Rad凝胶成像系统；Taq DNA聚合酶、dNTPs及200 bp DNA Ladder marker购自TaKaRa公司；ISSR引物根据加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的序列，由上海生工生物工程公司合成，经初步筛选，确定UBC881（序列为GGGTGGGGTGGGGTG）为此次试验的引物。
1.3 基因组DNA的提取及检测根据本课题组建立的方法提取与检测，详见文献［7］。
1.4 ISSR-PCR初始条件及程序参考有关ISSR分析的文献［8～10］，设计何首乌ISSR-PCR初始25 μl反应体系：1×Taq酶配套缓冲液，DNA模板50 ng ，1U Taq DNA聚合酶，1.5 mmol/L MgCl2，0.4 μmol/L引物，0.2mmol/L dNTPs。扩增程序为：94℃预变性5 min；然后是94℃变性45 s，56℃复性1 min，72℃延伸1.5 min，共35个循环；72℃延伸7 min，反应结束后，4℃保存。
1.5 ISSR-PCR产物检测扩增产物在含有EB的1.6%（W/V）的琼脂糖凝胶中电泳分离，电压5 V/cm。电泳结束后，在凝胶成像系统上观察并照相记录。
1.6 退火温度的确定采用梯度PCR模式，设定退火温度最低48.0℃和最高63.0℃，扩增仪自动生成12个温度梯度：48.0，48.8，49.8，51.2，53.2，55.1，56.6，58.4，60.3，61.5，62.4，63.0℃。其余PCR扩增程序同“1.4”，以确定最合适的退火温度。
1.7 何首乌ISSR-PCR扩增反应体系的优化ISSR-PCR扩增反应体系的优化采用单因素实验。DNA模板量设5，10，20，40，60，80，100，120，160，200 ng 10个浓度梯度；Taq DNA聚合酶设0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0U共6个梯度；Mg2+设0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mmol/L 7个浓度梯度；引物设0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 μmol/L 7个浓度梯度；dNTPs设0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35 mmol/L 7个浓度梯度。每一个合适条件确定后，作为后续研究的一个条件。
2 结果
2.1 退火温度的确定
PCR反应中，退火温度的高低直接影响到引物与模板DNA的特异性结合。如图1所示，当退火温度为48.0～55.1℃时，扩增的条带亮度弱且杂带多；退火温度为56.6℃时条带亮度增强但主带缺失；退火温度为58.4～60.3℃时，扩增的条带之间界限分明、亮度适宜、背景清晰；温度为61.5～63.0℃时，随着温度的升高，扩增条带逐渐减少，亮度减弱。通常较低的退火温度在保证引物与模板结合稳定性的同时，也会使引物与模板之间未完全配对的一些位点间得到扩增，产生非特异性条带。因此，在允许的范围内，选择较高的退火温度可减少引物与模板之间的非特异性结合，提高反应的特异性［11］。本研究中，合适退火温度的范围为58.4～60.3℃，选择何首乌最适退火温度为60℃。以下实验均应用这一退火温度。
2.2 模板DNA浓度对ISSR扩增的影响
模板浓度对PCR产物的特异性和稳定性影响不大，如图2所示，除模板量在5 ng时扩增产物少外，其余10～200 ng范围内扩增谱带大致相同，只是扩增强度略有差异。模板量为10～100 ng时，随着模板浓度的增加，扩增的产物量有所增加，100 ng时条带最亮；再加大模板用量，120～200 ng时，随着模板量的增加，扩增的谱带亮度反而减弱。因此，我们将何首乌ISSR-PCR扩增的模板用量选定为每个反应100 ng。
学术科研网 2.3 Taq DNA聚合酶对ISSR扩增的影响
Taq酶的活性与用 量关系到扩增能否正常进行，是ISSR-PCR反应中重要的因子。如图3所示，当酶用量为0.5 U时产物量低；在1.0～2.0 U时扩增条带相同，都可获得良好的扩增效果；增大酶用量为2.5～3.0U时扩增条带产物反而减少，这与一些文献［12，13］报道相同，酶量过高反而引起PCR扩增效果的降低。本研究选择每个反应1.5 U的酶量作为何首乌ISSR反应的最佳酶用量。
2.4 Mg2+浓度对ISSR扩增的影响
Mg2+浓度对ISSR-PCR反应的特异性和扩增效率均有较大影响，浓度过高使非特异性扩增产物增加，浓度过低使扩增产物减少或导致扩增反应失败。如图4所示，Mg2+浓度为0.5～1.0 mmol/L时，没有扩增产物或只有极少数几条带；Mg2+浓度为1.5 mmol/L时，能得到清晰稳定的条带；Mg2+浓度为2.0～3.5 mmol/L时，扩增的非特异性条带增多且背景模糊。因此，本研究选择1.5 mmol/L的Mg2+浓度作为何首乌ISSR反应的最佳浓度。
2.5 引物浓度对ISSR扩增的影响
引物浓度的高低也是PCR反应中的影响因素。如图5所示，引物浓度为0.2 μmol/L时，扩增很弱；引物浓度为0.4～1.0 μmol/L时，扩增条带相同，但以0.6 μmol/L时，条带最清晰明亮；引物浓度大于1.0 μmol/L时，大分子量条带缺失且非特异性产物增加。本研究选择0.6 μmol/L的引物浓度作为何首乌ISSR反应的最佳浓度。 2.6 dNTPs浓度对ISSR扩增的影响
dNTPs浓度直接影响PCR扩增产物的生成。如图6所示，dNTPs浓度为0.05～0.10 mmol/L时，扩增的条带少且强度较弱；0.15～0.25 mmol/L时条带多且清晰，相对而言0.20 mmol/L条带更亮些；大于0.25 mmol/L时扩增产物明显减少。因此，本研究选择0.20 mmol/L的dNTPs浓度作为何首乌ISSR反应的最佳浓度。
3 讨论
ISSR扩增易受多种因素的影响，如模板DNA、Taq酶、dNTPs、Mg2+以及引物等，扩增条件的变化会对ISSR图谱产生较大的影响，从而影响ISSR分析的准确性和稳定性，因此为了获得重复性和可靠性高的ISSR图谱，对何首乌进行引物的筛选、PCR扩增条件的优化及不同引物的退火温度的确定十分必要。本实验采用单因素完全实验设计，逐一研究各因素不同处理水平的影响，比较系统和精细地研究了各主要因子的影响，较快地建立了适合何首乌的ISSR-PCR优化体系，为后续实验奠定了技术和理论基础。 退火温度对扩增条带的清晰程度有明显影响。引物的碱基构成不同，适宜的退火温度就可能不同，因此，只有根据引物序列的碱基构成进行相应的退火温度设计、优化，才能获得清晰、稳定的扩增带。
反应条件的变化对ISSR扩增影响较大，特别是Mg2+浓度。Taq DNA聚合酶是Mg2+依赖性酶，对Mg2+浓度非常敏感。选择合适的Mg2+浓度，对PCR反应至关重要，引物和模板的双链杂交体的解链和退火温度也受二价阳离子的影响，特别是其中的Mg2+浓度能影响反应的特异性和扩增片段的产率。Mg2+浓度过低时，酶活性显著降低；过高时，则酶催化非特异性产物的扩增。而且，PCR反应体系中的模板DNA、引物及dNTPs的磷酸基均可与Mg2+结合，影响Mg2+的实际浓度，因此在实验的反应体系中，Mg2+是一个较难把握的因素，需要加以重点考察。 本研究结果显示，何首乌ISSR反应优化的扩增体系为：25 μl反应体系中，含1×Taq酶配套缓冲液、100 ng模板、1.5U Taq DNA聚合酶、1.5 mmol/L Mg2+、0.6 μmol/L引物、0.2 mmol/L dNTPs。扩增程序为：94℃预变性5 min；然后是94℃变性45 s，60℃（引物UBC881）复性1 min，72℃延伸1.5 min，共35个循环；循环结束后72℃延伸7 min，4℃保存。
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