作者：朱冬春 黄赵刚 夏泉 程钢 孙红玲 宋士卒 卫修来 葛朝亮 刘钢
【摘要】 目的建立栀子中京尼平苷的含量测定方法，在此基础上考察栀子中京尼平苷的提取方案。方法高效液相色谱法测定含量，采用Kromasil C18（250 mm×4.6 mm,5 μm）色谱柱，流动相为乙腈-水（15∶85）；流速为1.0 ml/min；检测波长为238.4 nm。栀子粉末先醋酸乙酯回流提取，滤渣再用80%乙醇回流，考察提取效率及京尼平苷纯度。结果京尼平苷在12.5～200 μg/ml范围内呈良好线性关系，r=0.999 8。用乙醇回流的提取方式可使京尼平苷提取较完全，醋酸乙酯提取所得京尼平苷纯度较高。论文论文参考网结论提取溶剂的种类对栀子中京尼平苷的提取效率及纯度有较大影响，先醋酸乙酯再乙醇的提取方法，可以得到部分纯度较高的京尼平苷，且不浪费药材，减少纯化等后续处理的难度。高效液相色谱法检测栀子中京尼平苷，方法快速、准确、可行。
【关键词】 京尼平苷；提取；测定；纯度；高效液相色谱
Abstract：ObjectiveTo develop an HPLC method for the determination of geniposide from gardenia. MethodsHigh performance liquid chromatography was used on ODS C18（250 mm×4.6 mm,5 μm）with acetonitrile-water (15∶85) as a mobile phase. The flow rate was 1.0 ml/min.The detection wavelength was 238.4nm. First a circumfluence was made by ethyl ,the residue was extraced by 80% ethanol. Then the rate and purity of Geniposide extracted via different extraction solvent and extraction method. ResultsThe linear range of geniposide was 12.5～200 μg/ml,r=0.999 8. The extraction method of ethanol could get a higher extraction rate of Geniposide, and a high purity with ethyl acetate instead. ConclusionThe type of solvent in the extraction of Geniposide from Gardenia affects the efficiency of extraction significantly. Make a sequential extraction by using ethyl first and then the ethanol, we can not only get the Geniposide in a high purity, but also waste little herbs. Determination of Geniposide in Gardenia can be done fast and exactly by HPLC .
Key words：Geniposide; Extraction; Determination; Purity; HPLC
栀子为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实。据2005版《中国药典》Ⅰ部记载,其具有泻火除烦、清热利尿、凉血解毒的功效，主治热病心烦，黄疸尿赤，血淋涩痛，目赤肿痛，火毒疮疡，扭挫伤痛，是一味临床常用的中药。近年研究表明，京尼平苷是主要有效成分之一［1］，其提取方法众多［2］。本文运用高效液相色谱法［3～5］建立京尼平苷含量测定方法，并在此基础上考察特定需要条件下京尼平苷的提取方式［6］，以便摸索出可行的提取工艺。
1 仪器与试药
1.1 仪器
RE-52型旋转蒸发仪，DL-5型大容量离心机，TGL-16H高速离心机，contrifuge电热恒温水浴锅，SB3200超声提取器，ZK-82B型真空干燥箱，XW-80A旋涡混合器；高效液相色谱仪系统：Agilent 1100型高效液相色谱仪（四元泵，自动进样系统，DA AD检测器，Agilent化学工作站）。
1.2 试药
栀子（粉碎过4号筛），京尼平苷对照品（中国药品生物制品检定所），甲醇(分析纯)、乙腈（分析纯,无锡亚盛化工有限公司），醋酸乙酯（分析纯），双蒸水。
2 方法与结果
2.1 HPLC分析方法的建立
2.1.1 京尼平苷溶液制备
样品溶液：取栀子药材粗粉末（过4号筛）约0.2 g，精密称定，置25 ml具塞容量瓶中，加入甲醇20 ml，定容后密塞称重，静置10 min后超声处理20 min，放冷称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，量取上清液待测。
标准品溶液:精密称取京尼平苷标准品适量，加甲醇配成100 μg/ml的溶液。
2.1.2 色谱条件
色谱柱为Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm,5 μm），流动相为乙腈-水（15∶85）；流速1.0 ml/min；进样量10 μl；检测波长238.4 nm；柱温25℃，按外标法进行定量分析。
2.1.3 系统适用性
按照“2.1.2”项下色谱条件分析京尼平苷对照品溶液及栀子药材样品溶液，色谱图如图1～2所示。理论塔板数以京尼平苷计为12 000,拖尾因子在0.95～1.05范围内,分离度大于1.5，未见样品中其他组分干扰京尼平苷的测定。
2.1.4 标准曲线
取京尼平苷标准品溶液（400 μg/ml）,进行倍比稀释，分别配制成浓度为200，100，80，50，25，12.5 μg/ml的京尼平苷对照品溶液，在上述色谱条件下进样测定。以栀子苷进样浓度（X）对峰面积（Y）进行线性拟合。
所得标准曲线方程为Y= 14.143X+ 18.545，R2=0.999 8，结果表明，京尼平苷在12.5～200 μg/ml浓度范围内呈较好的线性。
?2.1.5 精密度实验
取京尼平苷对照品溶液，在上述色谱条件下分别重复进样5次，进行测定，计算结果京尼平苷峰面积的RSD为1.32％。
2.1.6 重复性实验
取同一栀子药材，按照栀子药材样品溶液的制备方法，平行制备5份，按前述色谱条件进行分析，取样为0.2 g，求得京尼平苷峰面积的RSD为1.83％。
2.1.7 稳定性实验
取“2.1.1”项下的样品溶液，分别在0,1,2,12,24,48h按前述色谱条件进样分析，求得京尼平苷峰面积RSD为1.13%
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2.1.8 回收率实验
准确称取栀子药材粉末50 mg共5份，分别加入对照品溶液适量（100 μg/ml×0.2 ml），按上述方法处理，测定京尼平苷的平均回收率和相对标准偏差（RSD）,可得京尼平苷平均回收率为99.8％，RSD为1.21％ 。
2.1.9 样品含量测定
取0.1 g京尼平苷粉末，按照“2.1.1”项下制备样品待测溶液，进样，将结果代入标准曲线，可得其浓度为0.251 mg/ml,计算京尼平苷含量为2.51％。
经过上述实验，已经建立HPLC法检测京尼平苷的可行条件，并制备出本实验条件下的标准曲线,即可准确测定京尼平苷含量。
2.2 提取方案
设计近年来关于京尼平苷的研究颇多，关于其提取方法的研究已比较全面，如李其兰［7］、廖夫生等［8］均比较了多种提取方法，以及进行正交实验，确定最优方案等，但其结论并非完全一致。笔者在这里主要考虑既要提取相对完全，又要得到纯度较高的京尼平苷，以便简化后续处理。从该要求出发，参阅文献［9］，选择先用醋酸乙酯提取，滤渣再用乙醇提取，并与直接用乙醇提取相比较。其中每种方案设平行3组。
2.2.1 先醋酸乙酯提取
再乙醇提取称取栀子果实粉末10.0 g，加入80 ml醋酸乙酯回流5 h，抽滤，溶剂（醋酸乙酯）洗涤3次，合并滤液，减压蒸馏，用蒸馏水溶解，抽滤，适量水洗涤后合并滤液，定容至100 ml，待测，滤渣备用。
2.2.2 滤渣乙醇提取
取“2.2.1”项下所得滤渣，加入80％乙醇160 ml回流3 h，抽滤，合并洗涤滤液，减压蒸馏，用蒸馏水溶解，抽滤，合并洗涤滤液定容至100 ml，待测。
2.2.3 直接乙醇提取
取栀子粉末10.0 g，加160 ml 80％乙醇回流3 h，抽滤，减压蒸馏，用蒸馏水溶解，抽滤，滤 液定容至100 ml，待测。
2.3 检测与结果
将“2.2.1”“2.2.2”“2.2.3”项下所得样品溶液，进行适当稀释（10倍）后，用所建立的HPLC方法进行分析，得出直接乙醇提取法得京尼平苷含量为2.43%，醋酸乙酯提取法得京尼平苷含量为1.03%，醋酸乙酯提取滤渣乙醇续提得京尼平苷含量为1.33%。直接乙醇提取法所得HPLC结果见图3。
《中国药典》提示，“2.1.1”项下的甲醇提取法能提取完全，相比较，“2.2.3”项下方法京尼平苷提取率高，提取完全，但杂质也较多；方法“2.2.1”所得溶液HPLC图谱杂质峰少、但提取不完全；“2.2.1”项方法与“2.2.2”项方法相结合，既能得到较高纯度的京尼平苷，又不造成其损失。
3 讨论
提取溶剂的种类对栀子中京尼平苷的提取效率及纯度有较大影响。京尼平苷易溶于水，但水渗透力差，不易将其从栀子粉末中提出。《中国药典》提示甲醇提取效率高，但其毒性较大，且残留会对后续药理学实验产生不利影响。乙醇提取法带出大量水溶性杂质，不易分离。醋酸乙酯提取法，可以得到较高纯度的京尼平苷，但提取不完全。
本文采用先醋酸乙酯提取，滤渣加用80%乙醇回流，提取方案既能得到部分纯度较高的京尼平苷，又能尽量提取完全。滤渣乙醇续提部分，由于总量减少，处理起来也相对方便，减少了后续处理的难度。研究表明，该提取方案可行、可靠；文中建立的HPLC方法具有较高系统适用性，能满足京尼平苷提取方法考察要求，可准确测定京尼平苷含量，方法可行，结果可信。
【参考文献】
［1］阴健，郭力弓．中药现代研究与临床应用(1)［M］．北京：学苑出版社，1993:471.
［2］薛惠中,陈昭文,胡俊宏，等．栀子清伤膏的制备工艺与质量标准［J］.南京中医药大学学报.1997,13(1):29.
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［4］胡震,杨广德,罗国安,等.栀子中栀子苷提取工艺优化及HPLC分析［J］.中成药，2006,28(3):336.
［5］刘欢莲.高效液相色谱法测定清开灵注射液中的栀子苷含量［J］.中国药物与临床,2006,6(5):361.
［6］王振华,杜勤,许晓峰,等.栀子提取工艺研究［J］.中药材,2000,23(4):224.
［7］李其兰,陈红专,张跃军,等.中药栀子提取方法的比较和工艺条件优化［J］.中国医院药学杂志,2004,24(6):327.
［8］廖夫生,付红蕾,乐长高,等.栀子中京尼平苷的提取与分离研究［J］.时珍国医国药,2005,16(2):89.
［9］涂盛辉,邱祖民,刘燕燕,等.中药栀子提取工艺优化［J］.中成药,2006,28(10):1519.
［10］杜守颖，郝博，吴清．对《中国药典》2000年版一部栀子中栀子苷含量测定方法的探讨［J］.中国药品标准,2003,4(2):12.
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