【摘要】 目的观察益气化淤中药对大鼠胃癌前病变胃黏膜蛋白激酶C（PKC）表达的影响。方法采用MNNG、乙醇、饥饱失常等多因素造模。造模型成功后，将造模存活大鼠随机分为自然恢复组，中药高、中、低剂量组, 各组大鼠作相应的处理后, 免疫组化法检测各组大鼠胃黏膜组织PKC表达水平。结果各治疗组PKC表达较自然恢复组下调,有显著性差异(P<0.05)。结论益气化瘀中药可能是下调PKC的表达，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，而发挥对大鼠胃癌前病变的治疗作用。论文学术科研网
【关键词】 胃癌前病变 蛋白激酶C 益气化淤中药
Abstract：ObjectiveTo observe the effect of Yiqi Huayu Recipe on the expression of protein kinase C(PKC) in rats with gastric precancerous lesions(GPL).MethodsThe model of GPL was established mainly through N-methyl-N-nitro N-nitrosoguanidine (MNNG) together with other factors including alcohol stimulation and undue hunger and overeating. The survived rats after modeling were randomly divided into spontaneous recovery, and high-, moderate-and low-dose of Yiqi Huayu Recipe group. After the corresponding treatment, the expression of PKC was detected by immunohistochemical method. ResultsThe expression of PKC in each treatment group were distinctly lower than that in spontaneous recovery group (P<0.05).ConclusionYiqi Huayu Recipe is effective in the treatment of rats with GPL by inhibiting the expression of PKC.
Key words：Gastric precancerous lesions; Protein kinase C; Yiqi Huayu Recipe
慢性萎缩性胃炎（CAG）伴中重度不典型增生或/和不完全性结肠型化生是胃癌的重要癌前病变。益气化淤中药临床治疗胃癌前病变取得了很好的治疗效果［1］，为了探讨其作用机制，特设计本实验，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 药物及试剂
甲硝基亚硝基胍(MNNG)为Fluka公司产品，每周用双蒸水配成1 g/L的母液4℃避光储存，临用时用双蒸水配成所需浓度；脱氧胆酸钠购自湖北省医药公司；雷尼替丁由杭州赛诺菲圣德拉堡民生制药有限公司生产；PKC小鼠抗大鼠单克隆抗体为SantaGruz 公司产品；生物素化山羊抗小鼠IgG(二抗)、辣根酶标记链亲合素(三抗)、DAB、封闭用山羊血清等为博士德试剂公司产品。益气化淤中药主要由太子参、石斛、三七、郁金、白花蛇舌草等组成，浓度2 g／ml。
1.2 造模及给药方法
选用SPF级6周龄SD♂大鼠62只，体质量100～120 g。造模参照严茂祥等［2～6］综合造模方法并加以改进。大鼠自购进后适应性喂养1 d。从62只大鼠中随机抽取13只作为正常组, 其余49只用于造模。正常组大鼠不做任何处理；造模大鼠每日自由饮用100 mg/L MNNG液(饮料瓶用油漆涂黑避光)、进食含0.3 g/L雷尼替丁的纯鼠饲料、上午用56℃ 150 g/L的氯化钠液按10 ml/kg灌胃，进食2 d，禁食1 d，进食当天下午用8.5 g/L脱氧胆酸钠溶液按10 ml/kg灌胃。禁食当天下午用400 ml/L乙醇按10 ml/kg灌胃，连续24周。24周末时随机抽取正常组和造模大鼠各1只，杀检，观察组织病理学变化(以HE染色光学显微镜下观察的结果为主)，确认模型是否成功。
造模型成功后，将造模存活的48只大鼠随机分为自然恢复组12只。中药高、中、低剂量组(简称高、中 中、低剂量组)各12只。高剂量组每日每只按20 g/kg(相当于成人1 d用量的两倍)灌胃，中剂量组按10 g/kg(相当于成人1 d用量)灌胃，低剂量组按5 g/kg(相当于成人1 d用量的50%)灌胃。上述治疗16周。自然恢复组同正常组大鼠常规饮食。40周末所有动物禁食1 d，处死，剖腹取胃，沿胃大弯剪开，生理盐水冲洗，肉眼观察，平铺于硬纸板上，于胃窦部剪取组织1块，40 g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋, 切片5 μm, 免疫组织化学染色。
1.3 PKC蛋白表达PKC一抗稀释倍数(1∶100)，染色步骤如下:切片脱蜡入水。3%H2O2室温孵育1 min,以灭活内源性酶。最后蒸馏水洗3次。将切片浸入TAB(0.05 mol/L，pH7.4)中,电炉加热至100℃,持续30 min。冷却后进行下一步。滴加抗原修复液,室温孵育10 min，蒸馏水洗3次。滴加正常5%山羊血清封闭液,室温孵育10 min，甩去多余液体。滴加稀释的一抗,4℃湿盒内过夜。TAB洗涤3次,每次5 min,滴加二抗室温孵育30 min。TAB洗涤3次，5 min/次，滴加三抗(HIGH-SABC)室温孵育30 min。TAB洗涤3次，5 min/次，DAB显色。自来水冲洗，苏木复染，封片。
1.4 观察方法及判断标准根据文献［7］加以改进。切片中出现黄染为阳性。每张切片由两位观察者独立计数,随机取染色区域4个高倍视野(×400)阳性细胞平均数,用半定量计分。染色强度用0～3级计分：0级为无染色；1级为轻度阳性染色；2级为中度阳性染色；3级为强阳性染色；染色范围根据细胞阳性染色的百分数而分为0～4级：0级为无染色；1级为5％～10％细胞染色?2级为10％～20％细胞染色；3级为20％～50％细胞染色；4级为>50％细胞染色。染色总评分为染色强度+染色范围。
1.5 统计学处理方法数据用±s表示, 组间差异性比较采用q检验，P<0.05认为有显著性差异。
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2 结果
PKC在正常组中主要存在于胞浆,其他组别中,除了胞浆外，在胞膜和胞核也可见。自然恢复组较对照组PKC表达增强,有非常显著性差异(P<0.01)；各治疗组较对照组PKC表达增强,但没有显著性差异(P>0.05)；各治疗组较自然恢复组PKC表达下调,有显著性差异(P<0.05)；各治疗组之间比较没有显著性差异(P>0.05)。结果见表1。表1 各组大鼠的PKC蛋白表达(略)
3 讨论
蛋白激酶C(PKC)是1977年由日本学者Nishizuka等［8］首次在鼠脑的胞质成分中发现的一种依赖磷脂和钙的蛋白激酶,其广泛分布于真核细胞中,由多种具有不同生物学特性的同工酶组成,是细胞内信号传导的重要递质。PKC通常处于失活状态,被激活后可由细胞质转位到细胞膜,能够使众多蛋白质中的丝氨酸和苏氨酸发生磷酸化而发挥作用。PKC的活化不仅与正常细胞和异常细胞的生长、分化、凋亡等多种生物学效应有关， 更在肿瘤的发生、发展、转移和多药耐药等方面发挥重要作用。有人采用不同浓度的PKC抑制剂Staurosporine(ST)作用于人胃癌细胞株MGC 803和SGC 7901后,细胞增殖受到明显抑制,表明PKC在胃癌细胞增殖中具有重要作用［9］。胃癌细胞增殖时,PKC活性表现为上调趋势,而诱导胃癌细胞凋亡时,它表现为下调趋势［10～12］，一些化疗药物和抑制增殖及诱导凋亡的药物如特异性环氧化酶 2抑制剂也通过下调PKC活性而抑制胃癌细胞生长［13，14］。
本实验结果表明，以MNNG为主的多因素联合攻击法诱发的大鼠胃癌前病变(自然恢复组)粘膜PKC蛋白表达明显增高，胃炎消能使PKC蛋白表达明显下降(与自然恢复组比较，P<0.05)，我们推测胃炎消可能是通过下调PKC的表达，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，而发挥对大鼠胃癌前病变的治疗作用。
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